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尊龙人生就是博生物大豆与黄瓜遗传转化项目范例

植物转基因技术合作项目范例(大豆)

接受某师范学院委托,将其提供的含两个外源基因的过表达载体转化大豆品种(Jack)。

一、转化操作

1.外植体制备

2.农杆菌侵染

3.诱导出芽

4.植株再生

5.分化生根

6.炼苗移栽


二、阳性检测

  因转化的是内源基因,以转化载体上35S启动子片段上游引物+目的基因片段下游引物的方式进行PCR扩增和电泳。

 注:“3-10”为再生植株,“WT”为野生型植株,“-”为空白对照,

“+”为阳性质粒对照,“M”为Marker


三、小结

  自农杆菌侵染之日起至炼苗移栽,共计48天,抽检10株再生苗通过PCR扩增目的基因,其中9株为双外源基因阳性。



植物转基因技术合作项目范例(黄瓜)

接受某农业大学委托,构建指定黄瓜内源基因的过表达及RNAi转化载体,并转化黄瓜。

一、载体构建

 (1)根据基因的ORF设计带酶切位点的引物;

 (2)提取黄瓜组织总RNA,反转录成cDNA为模板,扩增获得单一片段,切胶回收后连接T载体pMD18,测序确认;

 (3)双酶切T质粒和pCambia2301载体,电泳回收后酶连,转化大肠杆菌,抗性菌落提取质粒进行酶切验证;

 (4)质粒转入农杆菌EHA105菌株,对抗性菌落进行PCR验证;

 (5)RNAi干扰片段通过不同酶切位点在PBSK中间载体的内元两侧形成正向和反向插入,再共同转移到pCambia2301载体上,转化农杆菌。


二、遗传转化

1.外植体制备

 

2.农杆菌侵染

3.诱导出芽

4.植株再生

5.分化生根

6.炼苗移栽


三、阳性检测

1.过表达检测

  因转化的是内源基因,以转化载体上35S启动子片段上游引物+目的基因片段下游引物的方式进行PCR扩增和电泳。

注:“1-7”为再生植株,“WT”为野生型植株,“-”为空白对照,

“+”为阳性质粒对照,“M”为Marker


2.RNAi检测

  以干扰片段上游引物+内元(茎环)片段下游引物的方式进行PCR扩增和电泳。

注:“1-9”为再生植株,“WT”为野生型植株,“-”为空白对照,

“+”为阳性质粒对照,“M”为Marker


四、小结